Microscopia del Nuevo Milenio
 
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MICROSCOPIA
DEL NUEVO MILENIO
  (Evolución histórica
de la microscopía de luz)
  Lic. Claus Poerner
KO-BE Representaciones Científicas C.A.
   
Desde que los holandeses Hans y Zacharias Janssen fabricaron el primer microscopio compuesto en 1590 y el naturista Antoni Van Leeuwenhoek, también de origen holandés, creó un microscopio "simple" que podía magnificar aproximadamente x275 veces un espécimen, han sucedido una serie de cambios muy importantes en el mundo de la microscopía de luz a través de los años hasta hoy. Muchos han sido los avances y descubrimientos que se han realizado desde entonces. Posteriormente a su creación, el microscopio de luz natural comenzó a experimentar cambios en su estructura y componentes, los cuales eran regularmente modificados por diversos investigadores y físicos especializados en óptica que intensificaron la búsqueda de mas y mejores imágenes.
art_fotoI.jpg (4160 bytes)Foto I
     
En 1827, el italiano Giovanni Battista Amici, construyó los primeros microscopios de alta calidad desarrollando la primera óptica acromática que corregía ciertas aberraciones ópticas, durante ese mismo año. Battista, fue el primero en reconocer la importancia del espesor de cobertura e introdujo el nuevo concepto de "inmersión en agua". Posteriormente, en Alemania, Carl Zeiss y Ernst Abbe desarrollaron los sistemas de "inmersión en aceite", utilizando diferentes aceites que corrigieron el índice de refracción del cristal óptico. En 1886, el Dr. Otto Schott formuló los lentes corregidos al color, creando así los primeros objetivos apocromáticos a finales de siglo.
     
Pero los cambios más importantes surgieron a partir de comienzos del siglo XX, al aparecer la luz eléctrica. El gran físico Alemán, el Dr. Koehler, desarrolló un nuevo sistema de iluminación, que aún hoy en día se maneja y lleva su nombre, agregando un diafragma de campo luminoso posterior a la emisión de luz emitida por un bombillo de bajo poder, y centrando la mayor intensidad de luz exactamente cubriendo el diámetro de cada lente frontal de cada objetivo en su apertura numérica específica, para de esta manera, poder aprovechar al 100% la luz emitida por la fuente emisora. Koehler reconoció que usando longitudes de onda mas cortas de luz (Ultra violeta) se podía mejorar la resolución de las imágenes obtenidas en el microscopio.
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Foto II
     
En menos de 60 años de historia, se desarrollaron diferentes sistemas de iluminación que permitieron a los investigadores y usuarios de microscopios, visualizar imágenes de especímenes nunca antes vistos. La invención de los sistemas de contraste de fase, permitieron visualizar una cantidad de microorganismos y bacterias vivas, sin la necesidad de que las muestras fuesen inertes y sin la necesidad de teñir las mismas para su observación.
   
art_fotoIII.jpg (9893 bytes) Foto III
     
La llegada de la luz episcópica, utilizada generalmente para ver muestras opacas, fue base para la aparición de la epi-fluorescencia que permitió la tinsión de muestras con reactivos fluorescentes a diversas longitudes de onda, y se visualizaron tejidos en cuyas estructuras se excitaban en forma separada, según el reactivo, obteniéndose diferencias muy importantes para los investigadores hasta el día de hoy.
 

art_fotoIV.jpg (15469 bytes)Foto IV

     
El campo oscuro permitió iluminar lateralmente el espécimen sin afectar su medio, permitiendo ver microorganismos como el Fitoplancton marino, microparásitos, etc.
     
art_fotoV.jpg (12130 bytes) Foto V
     

También surgió en este siglo, el contraste diferencial de interferencia (DIC-Nomarski) diseñado para observar relieves de especímenes muy difíciles de manejar, utilizado mucho en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales (FOTO V). Dependiendo de la aplicación, surgieron también los diferentes tipos de microscopios para diferentes usos, como los microscopios invertidos para visualización de cultivos vírales, vacunas, etc.

Los microscopios metalúrgicos, petrográficos, de polarización, estereoscópicos, médico-quirúrgicos, etc.

Ya a finales del siglo XX, cerca de 1991, se comenzó a experimentar con los diferentes avances de la cibernética actual, y se comenzaron a utilizar las cámaras de vídeo que surgieron en los años 50, ya mejoradas, con sistema de fotoceldas para circuitos cerrados (Tipo CCD), no solo como capturadoras de imágenes en movimiento o estáticas, sino como recurso de obtención de imágenes digitales. En principio, este accesorio permitió a los usuarios a visualizar en monitores las imágenes obtenidas de los microscopios de luz y eran generalmente utilizados con fines docentes. Pero, con la aparición de los nuevos software para análisis de imágenes, a principios de la década de los noventa, se ha comenzado a utilizar estos sistemas con mas frecuencia para muchas aplicaciones, ya sean científicas, de docencia, diagnóstico y para simple edición de imágenes. Inclusive, en años recientes la fotografía digital ha hecho su aparición para ser adaptada a los microscopios igualmente.

     
art_fotoVI.jpg (15059 bytes) Foto VI
     
La aparición de la red internacional de computadoras INTERNET a comenzado a permitir que los microscopistas intercambien imágenes de alta resolución en cuestión de segundos para discutir casos con fotografías digitales en diferentes formatos compatibles entre sí. Actualmente en desarrollo, se están diseñando diversos tipos de programas docentes para los estudiantes, que inevitablemente tendrán que verse inmersos en esta nueva pero muy ventajosa tecnología antes de finalizar el año en curso. En nuestro país, por ejemplo, ya se imparten clases de post-grado a través de INTERNET.
   
Por otra parte, y para investigaciones de mayor nivel, se han desarrollado también los sistemas de microscopía confacal, que encierran una mezcla de tecnologías con la imagen óptica obtenida en un microscopio de luz, con iluminación de amplia longitud de onda, óptica de muy alta resolución, y con sistemas de barrido de imágenes mediante una fuente de luz láser con difracción limitada. Esta nueva y pujante tecnología, es combinada con un muy avanzado sistema de adquisición de datos que procesa las imágenes obtenidas del microscopio con software iguales a los anteriormente nombrados. El mismo, ha permitido visualizar especímenes muy específicos como por ejemplo; la asimilación de calcio que se observa en las neuronas durante los impulsos nerviosos o sub-microparásitos en fibras de raíces pertenecientes a plantas acuáticas.
 

art_fotoVII.jpg (17948 bytes)Foto VII

Pero ya en vísperas de finales de siglo, la microscopía de luz ha experimentado cambios muy drásticos e importante en sus sistemas ópticos tradicional. Tanto así, que las nuevas ópticas no son compatibles, ni siquiera, con equipos que fueron fabricados hasta fines de 1996 por la mayoría de las casas comerciales más importantes en el ámbito mundial. Esta nueva óptica ha sido llamada "Óptica al Infinito" que ya se ha hecho eco en los oídos de todos los microscopistas.

Pero antes de que el usuario adquiera uno de estos nuevos sistemas, debemos analizar muy cuidadosamente si estos fabricantes de microscopios realmente han desarrollado este sistema para llenar las expectativas de los usuarios. Es cierto que este sistema mejora mucho la flexibilidad del equipo. ¿Pero, es realmente superior el desarrollo del sistema óptico infinito al del sistema óptico finito?

En un sistema óptico finito, después de que la luz pasa a través del objetivo, se dirige hacia el plano de la imagen primaria (localizado en el punto de foco del ocular) y converge ahí.

     
art_fig1.jpg (5456 bytes) Fig. 1
     
En un sistema óptico al infinito, sin embargo, la luz se convierte en un flujo de rayos paralelos después de pasar por el objetivo y no converge hasta que pasa a través del lente del tubo.
     
art_fig2.jpg (7278 bytes) Fig. 2
     
Esto no significa que se puede obtener una distancia al infinito después de que la luz pasa el objetivo (hasta el lente del tubo). Después de pasar a través del objetivo, la luz del objeto en el eje óptico se mueve paralela a este eje a través del eje óptico. La luz que viene de la periferia del objeto forma un flujo de luz de rayos paralelos y avanza en un ángulo diagonal al eje óptico.
     
art_fig3.jpg (6989 bytes) Fig. 3
   

Debido a esto, hay momentos en estos rayos de luz ya no pueden ser capturados por los lentes del tubo si la localización del lente del tubo se encuentra muy lejana al objetivo. Esto causa que la imagen cercana a los bordes del campo de observación se conviertan es oscuras ó borrosas, evitando que el microscopio se desarrolle a todo su potencial. El término de óptica al infinito simplemente significa que la luz se convierte en un flujo de rayos paralelos después de pasar a través del objetivo, no que existe un espacio infinito dentro del sistema óptico.

Si vamos a adoptar el sistema óptico infinito para desarrollar el microscopio, se necesita utilizar la mayor distancia entre el objetivo y el tubo del lente, así como seleccionar los equipos que más permiten la flexibilidad del sistema. En vista de que los aumentos (mo) del objetivo en un microscopio con sistema óptico al infinito se obtienen utilizando la fórmula: mo = distancia focal del lente del tubo (ft) / distancia focal del objetivo (Fig. 2). Naturalmente, esto hace que el tamaño del microscopio sea mayor. Y teniendo esto en mente, concluimos que se recomienda un sistema que tenga una distancia focal mayor para el lente del tubo. Existen fabricantes que ya lo hacen con distancias de 160mm, 180mm y con 200mm respectivamente.

Para obtener del mismo tamaño una imagen de un objeto localizado lejos del eje óptico, la mayor distancia focal del lente del tubo produce un ángulo menor de luz en contra del eje óptico. Los rayos de luz no se dispersan hacia afuera, así la distancia entre el lente del tubo y el objetivo se puede aumentar el potencial de flexibilidad del sistema.

     
art_fig4.jpg (18444 bytes) Fig. 4
     
Este diseño tiene ciertas ventajas ópticas. Como se muestra en la figura 5, cuando el lente del tubo de 160mm y 200mm produce un flujo de rayos de luz fuera del eje con un ángulo más pequeño. En este contexto, los rayos que pasen a través del anillo de fase en un aditamento para contraste de fase, el prisma DIC en un aditamento de DIC Nomarski, producen menor movimiento entre la luz de los elementos paralelos al eje óptico y de aquellos diagonales a este, así los accesorios trabajan con mayor eficiencia. Esta gran ventaja óptica, y también un factor primario que contribuye a un mejor nivel de contraste en la microscopía para epi-fluorescencia.
     
art_fig5.jpg (15811 bytes) Fig. 5
     

Una vez que la distancia focal del lente del tubo es 200mm, la distancia focal del lente del tubo se colocó a 200mm, la distancia parafocal del objetivo tuvo que incrementarse del standard de 45mm.

Tal como se explicó en la anteriormente, la longitud focal del objetivo también aumenta para conservar el mismo aumento y como en este diseño 45mm no proporcionan el espacio óptimo, no puede conseguirse una imagen óptica de calidad superior. En la práctica, el objetivo de aceite Plano Apocromático 60X con un tubo mecánico 160mm de longitud, que se pensaba que era lo último en objetivos finitos, está lleno de lentes en un espacio limitado de 45 mm. Cuando este sistema finito se sustituye por un sistema infinito y el objetivo se divide en un objetivo y una lente de tubo, la longitud focal de la lente del tubo se convierte en el equivalente a aproximadamente 150mm. Sobre esta base, podemos calcular el rendimiento óptico que sobrepasa al de un sistema finito como sigue:

La distancia parfocal del objetivo del sistema finito = 45mm; para una longitud focal de la lente del tubo de 150mm, la distancia parfocal del objetivo del sistema infinito = x; y la longitud focal de la lente del tubo = 200mm; al resolver esta proporción, si 45 : 150 = x : 200, entonces x = 60mm. Por lo tanto, si la longitud focal de la lente del tubo = 200mm, la distancia parfocal óptima del objetivo tiene que ser 60mm.

Varios fabricantes actuales han fijado la distancia parfocal de los objetivos de sus sistemas ópticos infinitos en 45mm, cosa que nos es recomendable dada la explicación anterior.

Estos cálculos muestran que es imposible que los microscopios producidos por todos los fabricantes de microscopios exploten el potencial total de sus objetivos.

Dado que la distancia de trabajo (DT) también aumenta para igualar la mayor longitud focal del objetivo, aquellos fabricantes que utilizan una distancia parfocal de 45mm están en desventaja al no poder utilizar la distancia de trabajo de mayor longitud.

Cuando se aumenta la longitud focal de la lente del tubo, también debe aumentarse la longitud focal del objetivo. El diámetro de la pupila del objetivo (diámetro efectivo que queda después de sustraer los límites del tamaño de la rosca del objetivo) presenta un límite, de manera que no puede obtenerse una alta abertura numérica (A.N.). Así pues, la A.N. de las lentes de baja potencia se ve críticamente afectada.

Actualmente, algunos fabricantes actualmente utilizan un tamaño de rosca de 20,32mm, pero, según hemos mencionado anteriormente, los mejores utilizan 25mm y son capaces de obtener una alta A.N.

En un principio, el brillo de las lentes fotográficas (F) se expresaba mediante la fórmula:

F = f / D [f: longitud focal de la lente; D: diámetro efectivo]

Dado que la A.N. de un microscopio corresponde al valor F de una lente fotográfica, el brillo puede expresarse mediante la fórmula:

F = 1 / (2N.A.)

El diámetro efectivo que se necesita para alcanzar una A.N. deseada puede, pues, encontrarse utilizando esta fórmula. En otras palabras, el tamaño de la pupila de un objetivo (diámetro efectivo en el lado de salida) se expresa como:

D = 2N.A.x f

Por ejemplo, para encontrar el diámetro efectivo del objetivo CFI Plano Apocromático 4X (N.A.0,2) con la A.N. más alta (máximo brillo), teniendo en cuenta que la longitud focal del objetivo es 50mm y que la longitud focal de la lente del tubo es 200mm, se hizo el siguiente cálculo:

D = 2 x 0,2 x 50 = 20mm

Esto demuestra que el tamaño de rosca convencional de 20,32mm no puede usarse físicamente.

Todas estas explicaciones, aunque un poco engorrosas, al ser acompañadas de ejemplos específicos, le servirán al lector y especialmente al microscopista del nuevo milenio, a entender porqué una lente de tubo con una longitud focal de 200mm se considera óptima en un sistema óptico infinito y porqué pueden obtenerse especificaciones ópticas más altas con objetivos de una distancia parfocal de 60mm y un tamaño de rosca de 25mm.

Aunque se ha seguido el estándar JIS así como otros estándares convencionales para las dimensiones mecánicas, la adopción de la óptica infinita en sí misma ha obligado a sacrificar en cierta medida la compatibilidad con los sistemas convencionales.

Así pues, en lugar de verse limitado por dimensiones convencionales, los fabricantes más importantes se han dado cuenta de que su verdadera tarea es la de crear productos que los usuarios necesitan en las técnicas de microscopía de vanguardia actuales. Las innovaciones en la ingeniería, fabricación, control de calidad, inspección y producción, han contribuido en conjunto al advenimiento las mejores series de sistemas ópticos para la actualidad.

El nuevo milenio nos depara nuevos retos como investigadores y microscopistas de éxito. Y nuestro eterno compañero, el microscopio de luz, nos continuará acompañando durante muchos años mas en nuestra constante lucha por lograr mejores imágenes que nos permitan dar diagnósticos exactos e inequívocos.


 
   
   
 
 
 
 
 

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